خالص سازی مهارکننده پروتئاز گوارشی سوسک کلرادو سیب زمینی (Leptinotarsa decemlineata Say) از آفتابگردان

عنوان دوره: اولین کنگره بین المللی حشره شناسی ایران

مهارکننده‌های پروتئاز پروتئین‌های کوچکی هستند که کمپلکس‌های بسیار پایداری با آنزیم‌های پروتئاز تشکیل می‌دهند و می‌توانند فعالیت آنزیم هدف را مهار نمایند. تولید مهارکننده-های پروتئاز یکی از روش‌های دفاعی گیاهان به شمار می‌رود، زیرا گوارش حشرات آفت را از نظر بیوشیمیایی مختل می‌کنند. هدف از این تحقیق، خالص‌سازی مهارکننده پروتئاز گوارشی سوسک کلرادو سیب زمینی(Leptinotarsa decemlineata Say) (Coleoptera: Chrysomelidae) از بذور آفتابگردان رقم رکورد (Helianthus annuus L.) است. بدین منظور، عصاره پروتئینی به دست آمده با روش ترسیب سولفات آمونیوم با اشباع 50-30% با بیشترین میزان مهارکنندگی روی فعالیت پروتئاز تام گوارشی لاروهای سن چهار سوسک کلرادو سیب زمینی، انتخاب شده و با استفاده از دو روش مختلف کروماتوگرافی خالص‌سازی گردید. کروماتوگرافی تعویض یونی با استفاده از ستون DEAE و سیستم کروماتوگرافی فاز مایع با فشار کم صورت گرفت. کروماتوگرافی تمایلی نیز با استفاده از دی اکسید سیلیکون (نانو پودر) به عنوان ماتریکس و روش سانتریفیوژ انجام شد. جهت تهیه ماتریکس کروماتوگرافی تمایلی، عصاره آنزیم گوارشی لارو سن چهار به عنوان لیگاند انتخاب شد. چهار پیک پروتئینی با استفاده از سه شیب مرحله‌ای سدیم کلراید 300، 600 و 1000 میلی مولار، از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی به دست آمد. فرکشن‌های فعال مربوط به پیک‌های به دست آمده با هم ترکیب، دیالیز و تغلیظ گردیدند. عصاره پروتئینی به دست آمده با روش ترسیب سولفات آمونیوم، سرین پروتئاز گوارشی لارو سن چهار این حشره را مهار ننمود. اما با استفاده از Z-Ala-Arg-Arg-4mßNA و آزوکازئین به ترتیب به عنوان سوبسترای سیسئین پروتئاز و پروتئاز تام، میزان خالص‌سازی فرکشن اول به دست آمده با روش تعویض یونی به 31/28 و 19/17 برابر رسید و درصد بازیافت آن 89/66 و 06/24% محاسبه شد، میزان خالص-سازی فرکشن به دست آمده با روش تمایلی نیز به ترتیب 98/26 و 77/12 برابر محاسبه و درصد بازیافت آن 96/53 و 52/25% برآورد شد. هر دو فرکشن پروتئینی خالص‌سازی شده از دو روش، دو باند مشابه با وزن مولکولی ظاهری 15 و 14 کیلودالتون در الکتروفورز واسرشت‌گر (SDS-PAGE) نشان دادند. به طور خلاصه، میزان خالص‌سازی و بازیافت بالای به دست آمده، نشان‌دهنده مناسب بودن این دو روش خالص‌سازی می‌باشد. نتایج به دست آمده از این تحقیق حاکی از این است که پروتئین‌های موجود در بذور آفتابگردان می‌توانند سبب افزایش مکانیزم دفاعی گیاه سیب زمینی تراژن شده علیه سوسک کلرادو سیب زمینی شوند.

سوسک کلرادو سیب زمینی؛ مهار پروتئاز گوارشی؛ خالص سازی پروتئین؛ کروماتوگرافی؛ آفتابگردان